W 1909 r. Browning, Cruickshank i M’Kenzie wykazali, że dodanie do antygenu cholesterolu zwiększa jego czułość. Zaczęto dążyć do ulepszenia opracowanego przez Wassermanna, Neissera i Brucka odczynu, opisując nowe metody, oparte na zasadzie odczynu Bordet-Gengou, w których badana surowica była bądź inaktywowana, bądź czynna. W tym ostatnim przypadku opierano się na założeniu, że w badanej surowicy znajduje się własny amboceptor i własny dopełniacz. Wśród licznych autorów, którzy opisali nowe metody wiązania dopełniacza, takich jak Sachs, Boas, Muller, Kaup, Calmette i Massol, Harrison i Wyler, Kolmer, Hecht i wielu innych, na szczególną uwagę zasługują: Kaup, dzięki wprowadzeniu dokładnego miareczkowania dopełniacza, oraz Kolmer, który wiązanie w okresie inkubacji prowadził nie tylko w temp. 37°, lecz również w temperaturze lodówki. Wspomniane wyżej odczyny — to makr o met ody. Opisano również wiele mikrometod odczynu wiązania dopełniacza, jednak żadna z nich nie znalazła dotąd szerszego zastosowania w codziennej diagnostyce serologicznej kiły. Ostatnio Schneeweiss zaproponował wprowadzenie do rutynowej sero- diagnostyki kiły póŁmikrometodę wiązania dopełniacza, opartą na technice Kolmera, w której ogólna objętość odczynników w probówce lub na odpowiednio wyżłobionej płytce plastykowej wynosi nie 3 ml, lecz 0,6 ml, a więc 5 razy mniej. Prawie że równocześnie z metodą wiązania dopełniacza starano się oprzeć diagnostykę serologiczną kiły na metodach Mączkujących (Fornet i Schereschevsky; Porges i Meier; Bruck i Hidalla , i inni). Jednak pierwsze odczyny kłaczkujące, które znalazły praktyczne zastosowanie w diagnostyce kiły, opisali Meinicke E. w 1917 r., a w rok później — Sachs i Georgi. W latach następnych ogłoszono całą lawinę nowych odczynów kłaczkujących lub ich modyfikacje. W ramach niniejszego podręcznika nie sposób opisać setek opracowanych modyfikacji, -i dlatego zostaną podane tylko te, które znalazły szersze zastosowanie w praktyce. Należą do nich odczyn skłębienia Mullera, odczyn cytocholowy Sachsa i Witebsky’ego, odczyn Kahna, odczyn Kline’a , odczyn Rein i Bossaka i odczyn Harris-Rosenberg-Reidla (VDRL-Test), a z metod kłaczkujących opartych na badaniu surowic nieinaktywowanych do najpopularniejszych zalicza się opracowane przez Meinickego E. odczyn zmętnienia i odczyn rozjaśnienia. Na podkreślenie wreszcie zasługuje opracowany w 1932 r. przez Chediaka odczyn MKR II w suchej kropli krwi, który doczekał się wielu modyfikacji (Dahr; Kriwonosowa; Vogt ; Meinicke i Fischer; Hamel; Fischer i Torchi). Dalsze uzyskiwanie lepszych wyników, zarówno metodami wiązania dopełniacza, jak i metodami kłaczkującymi, zależało od sposobu przygotowania antygenu. Jako antygenów powszechnie używano nie oczyszczonych alkoholowych wyciągów z narządów zwierzęcych. Wprawdzie już Heymann i Goyer w 1917 r. wykazali, że najaktywniejszym serologicznie składnikiem alkoholowych wyciągów lipidowych jest sól amonowa dwuamidofosfatydu, a Scaltritti w w 1928 r. wytrącił z tych wyciągów za pomocą CdCla serologicznie czynne iosiolipidy, jednak doniesienia te poszły w zapomnienie. Dopiero prace Pangborn z 1941 r. przywróciły temu zagadnieniu właściwe znaczenie. Autorka wyizolowała z serca wołowego chemicznie czysty fosfo- lipid, który nazwała kardiolipiną, oraz czystą lecytynę. Obie te substancje oddzielnie były serologicznie nieczynne, jednak zmieszane w odpowiednim stosunku wykazywały bardzo dużą aktywność. Od tego czasu zaczęto coraz częściej zastępować nie oczyszczone alkoholowe wyciągi antygenami sporządzonymi z mieszanki kardiolipiny, lecytyny i cholesteryny, ewentualnie z dodatkiem balsamu toluańskiego, używając ich zarówno w odczynach wiązania dopełniacza, jak i w odczynach kłaczkujących. W dalszych badaniach Uroma wyizolował podobną do kardiolipiny substancję z ziaren pszenicy, a Faure — z innych materiałów roślinnych. Z chwilą gdy Foitowi udało się na drodze syntetycznej zestawić kwaśne fosfatydy, których aktywność i swoistość okazały się podobne jak kardiolipiny, starano się również uzyskać syntetyczną lecytynę, by zestawić w pełni syntetyczny antygen dający się standaryzować. Jednak takie antygeny, zestawione z wszystkich uzyskanych na drodze syntezy składników, okazały się gorsze od antygenów przygotowywanych wg przepisu Pangborn.